流体力学によりTGFを介して線虫の体長が変化する

npj 微小重力 2 巻、記事番号: 16006 (2016) この記事を引用

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メトリクスの詳細

骨格筋の消耗は、長期にわたる宇宙探査にとって大きな障害となります。 宇宙飛行士と同様に、線虫 Caenorhabditis elegans は、宇宙の微重力下では筋肉や身体に悪影響を及ぼします。 どのようなシグナル伝達分子や行動がこれらの負の変化を引き起こすのかは依然として不明である。 今回我々は、流体力学に応答した線虫の体格の変化に関与する重要なシグナル伝達分子を地上実験で研究した。 線虫を 1G 加速器上の宇宙空間に置くと、ミオシン重鎖 myo-3 とトランスフォーミング成長因子 β (TGF-β) dbl-1 の遺伝子発現が増加しました。 これらの変化は、流体力学パラメータの粘度/抗力や液体培養の深さが地上で増加した場合にも発生しました。 さらに、液体培養で増殖させた野生型および体壁キューティクルコラーゲン変異体 rol-6 および dpy-5 では体長が増加しました。 対照的に、TGF-β、dbl-1、または下流シグナル伝達経路である sma-4/Smad 変異体では体長は増加しませんでした。 同様に、液体培養における dbl-1 発現の増加と体格の変化には、D1 様ドーパミン受容体である DOP-4 と機械感覚チャネルである UNC-8 が必要でした。 C. elegans の収縮率は、寒天表面を這うときよりも液体中を泳ぐときの方がはるかに高いため、体長の増加と収縮率の関係も調べました。 収縮率が大幅に低下した変異体は、通常、より小型でした。 ただし、dop-4、dbl-1、および sma-4 変異体では、液体中での収縮率は依然として増加しました。 これらの結果は、TGF-β/DBL-1を介した神経筋シグナル伝達が、流体力学を含む環境条件に応答して身体の体格を変化させるように作用することを示唆している。

個人の体格は、外部刺激と運動歩行の両方によって長期間にわたって形成されます。 骨と筋肉の消耗は、宇宙飛行などの微小重力環境や、寝たきりなどの非活動状態では避けられない病態生理学的適応です。1-4 これらの組織の消耗は、長期にわたる宇宙探査にとって大きな障害となります。 特に微小重力は機械的負荷を著しく減少させ、また静水力を含む流体力学に劇的な変化をもたらします。 しかし、どのようなシグナル伝達分子や行動がこれらの病態生理学的適応を引き起こすのかはまだ不明です。

水中運動は、最適な体力を獲得し、活力を高めるための最良の方法の 1 つです。 このような運動には、流体力学、特に液体の粘性に伴う静水力や抗力の物理的応用が含まれており、健康な人だけでなく寝たきりの患者にも効果的です。5-10 最近の多くの研究では、流体力学パラメータを物理的刺激として評価していますが、これらの刺激の知覚機構と、これらの刺激から骨や骨格筋の形成、体格や筋力の強化へのシグナル伝達のメカニズムは依然として不明である。

Caenorhabditis elegans は自由生活性の線虫であり、実験動物としても広く使用されています。 体長は、高度に保存されたトランスフォーミング成長因子-β (TGF-β)/DBL-1 Smad 転写因子シグナル伝達経路を介して変化する可能性があります。11-16 C. elegans には少なくとも 2 つの異なる運動歩容があり、1 つは泳ぐときに表示されます。水泳歩行から這い歩きへの移行、およびその逆の移行は、短期的な適応反応として生体アミンによって制御されます。21 C. エレガンスもまた、液体に対して短期適応します。触覚ニューロンに見られるデジェネリン イオン チャネル、MEC-4 および MEC-10 で構成される機械感覚複合体を介して、穏やかな機械的刺激に反応して移動します 22–25。線虫も長期にわたる適応反応を行います。 例えば、我々は、宇宙飛行により、筋肉の太いフィラメント、他の細胞骨格要素、ミトコンドリアの代謝酵素など、いくつかの筋肉遺伝子の発現低下が誘導されることを再現性をもって発見しました26-29。 これらの遺伝子発現の変化は、宇宙飛行中の体長と脂肪蓄積の変化と一致しているようです29。

この研究では、流体力学特性 (微小重力、粘度/薬剤耐性、液体培養の深さ) に応じた筋肉ミオシンおよび TGF-β 遺伝子発現の変化を調査しました。 また、確立された体格と、液体中で培養された線虫と湿った寒天表面で培養された線虫が示すさまざまな移動行動、それぞれ泳ぐ行動と這う行動との関係も比較しました。 最後に、我々は、TGF-β/DBL-1 を介した神経筋シグナル伝達が、流体力学特性に応じて変化した体格を調節するという仮説を調査しました。

私たちの C. エレガンス RNA 干渉宇宙実験 (CERISE) では、L1 幼虫段階の動物を、微小重力環境または国際宇宙ステーションの日本実験棟に搭載された 1G 遠心分離機のいずれかで、液体培地中で 4 日間、成体になるまで同時培養しました。線虫 L1 幼虫は、2009 年 11 月 16 日にスペースシャトル アトランティス STS-129 で国際宇宙ステーションに打ち上げられました。培養は 2009 年 11 月 20 日に開始され、4 日後に凍結され、培養後の凍結サンプルは宇宙から返送されました。 Shuttle Endeavour、STS-130、2010 年 2 月 21 日。マイクロアレイ発現分析により、筋肉の太いフィラメント、細胞骨格要素、およびミトコンドリア代謝酵素のレベルが、1G 遠心分離機での並行培養と比較して減少したことが示されました (95% 信頼区間 (P⩽0.05):さらに、微小重力環境で培養された線虫の体長は、1G 搭載遠心分離機で培養された線虫と比較して、わずか (約 5.5%) ではありましたが、大幅に減少しました。29 この研究では、ミオシン重鎖、 myo-3、TGF-β、dbl-1 の遺伝子発現は、微小重力環境では遠心分離機に比べてそれぞれ 60%、70% 減少しました (図 1a)。 これらの観察は、体長の減少が、筋肉遺伝子の転写抑制および/またはdbl-1発現の減少によって引き起こされるTGF-βシグナル伝達の減少によって引き起こされる微小重力への病態生理学的適応による可能性があることを示唆しています。

国際宇宙ステーションでの 1G の修復は、地上実験で液体の粘度や培養深さを増加させるのと同じように、myo-3 および dbl-1 遺伝子の発現を増加させます。 myo-3 および dbl-1 遺伝子発現レベルは、日本実験棟 KIBO30,31 での C. elegans RNAi 宇宙実験 (CERISE) 中に、1G 加速の有無にかかわらず、液体培養され宇宙飛行された野生型動物 (成体 4 日) でモニタリングされました。 (a)。 野生型動物を、L1 幼虫期から 1.0% (36.1 cSt) および 1.5% (123.3 cSt) のメチルセルロースを含む異なる粘度の液体中で 4 日間成長させました (b)。 野生型動物を、OP50 NGM 液体培地の指定の深さに浸した OP50 線虫増殖培地 (NGM) 寒天上で L1 幼虫期から 4 日間増殖させました (c)。 dbl-1 および myo-3 遺伝子発現の変化は、定量的リアルタイム PCR によってモニタリングされました。

地上実験では、myo-3 および dbl-1 遺伝子発現に対する流体力学パラメーターである抗力の影響を研究するために、野生型線虫を L1 幼虫期の後にさまざまな液体粘度の下で 4 日間培養しました。 (1.0 cSt (0% メチルセルロース)、36.1 cSt (1.0% メチルセルロース)、および 123.3 cSt (1.5% メチルセルロース))。 myo-3 遺伝子発現は、粘度 36.1 cSt で有意に増加し、123.3 cSt で中程度増加しました。 dbl-1 遺伝子発現は、123.3 cSt で約 20% わずかに増加しました (図 1b)。 成長速度と発育タイミングは粘度によって大きく変化せず、すべての L1 幼虫は 4 日目に妊娠し成熟した雌雄同体成体に発育しました。 妊娠中の成体では、1.5% メチルセルロースで育てた動物で予想されるほど体長は増加しませんでした。これはおそらく、より高いメチルセルロース濃度が線虫を脱水し、および/または消化と吸収を阻害することを示唆しています。

液体培養の深さを変える効果を研究するために、OP50 線虫増殖培地 (NGM) 寒天を追加の OP50 NGM 液体培地 (深さ 0.6、1.2、または 1.8 mm) で覆いました。 最も浅い状態では、ミミズは完全に液体に覆われ、移動行動は泳ぐように変化しました。 妊娠中の成人 (4 日目) では、myo-3 および dbl-1 遺伝子発現は両方とも液体培養の深さが増加するにつれて増加し (図 1c)、観察された最大発現は 1.2 mm で達成されました。 異なる液体深さで培養された線虫の体長は、わずかに大きくなりましたが、有意ではありませんでした (0.6 mm: 1.35±0.06 mm、1.2 mm: 1.36±0.07 mm、1.8 mm: 1.37±0.04 mm、グループあたり n=21 線虫、P> 0.1）。 これらの結果は、線虫 C. elegans が流れの動的パラメーターに応答して筋肉および TGF-β 遺伝子の発現を変化させることができることを示しています。 しかし、さまざまな深さで培養された線虫の遺伝子発現と体長のデータは、線虫が完全に水中に沈むと培養深さに対する反応が飽和するか、全か無かの反応であることを示唆しています。

流動力学的パラメーターを変更すると、myo-3 および dbl-1 の発現が増加しましたが (図 1)、地上の液体中での培養に応じた顕著な変化の規模は小さかったです。 C. elegans がさまざまな環境刺激や移動行動に応じて遺伝子発現と体格を変化させるかどうか、またどのように変化させるかをさらに調査するために、固定深さの液体培地または液体培地で増殖させた野生型線虫の遺伝子発現レベルと体長を測定しました。 「方法」に記載されているように、湿った寒天表面上に置きます。 培養は、寒天プレート上で孵化した L1 幼虫と並行して行われ、その後液体または寒天上で培養されました。 成長速度と発育タイミングは培養条件間で有意な差はなく、産卵の開始によって証明されるように、すべての幼虫は培養開始から3日後に若い成体雌雄同体に発育した。 ただし、4日目（妊娠成体段階）の体長は、湿った寒天と比較して液体培地で培養した動物の方が有意に長かった（図2a、b）。 この差はその後の時点でも持続しました (5 日目と 6 日目、図 2c)。 ミオシン重鎖遺伝子 myo-3 とその上流転写因子 hlh-1 の発現レベルも、液体培養した動物と寒天培養した動物で有意に高かった (図 2d、e)。 ミオシンタンパク質の発現レベルも同様に、寒天と液体で培養した動物で 1.6 倍増加しました (リボソームタンパク質の相対比と比較すると、液体で 1.24 倍、寒天で 0.78 倍)。

異なる培養条件下で増殖させた線虫における体長およびmyo-3およびhlh-1の遺伝子発現レベルの変化。 L1 幼虫期から開始して 4 日間、湿った寒天プレート (a、ピンクで表示) または液体培養 (b、青で表示) で増殖させた野生型の妊娠した成体の雌雄同体。 (c) 体長は液体培養と寒天培養により有意に増加しました。 myo-3 (d) および hlh-1 (e) 遺伝子発現レベルの変化は、定量的リアルタイム PCR によってモニタリングされました。 データポイントとエラーバーは平均値±標準偏差を示します (各時点あたり n=60 匹の虫、**P≤0.01)。

DBL-1 は、TGF-β タンパク質ファミリーのメンバーです。 DBL-1 は、そのシグナル伝達経路とともに、線虫の体長の調節因子として知られています 11-16。観察された体長変化に DBL-1 が必要かどうかを判断するために、dbl-1(wk70) と (wk70) の長さを測定しました。 nk3) 液体または寒天上で培養した後の変異体。 SMA-4 は体のサイズを制御する DBL-1 シグナル伝達カスケードの下流転写因子成分として知られているため、sma-4(e729) 変異体も測定しました。 野生型 (図 2 および 3) とは対照的に、これらの変異体の体長は液体培養では増加しませんでした (図 3)。これは、dbl-1 および sma-4 が液体培養に応答した体長変化に必要であることを示唆しています。 。

DBL-1 とそのシグナル伝達経路は、液体培養条件に応じた C. elegans の体長変化に必要です。 L1 幼虫段階から開始して、湿った寒天プレート (a) または液体培養 (b) で 4 日間増殖させた dbl-1(wk70) 妊娠雌雄同体成体。 （ c ）液体または寒天上で4日間増殖させた野生型、dbl-1（wk70）、dbl-1（nk3）、およびsma-4（e729）の体長を測定しました。 バーとエラーバーは平均値と標準偏差を示します (条件あたり n=30 匹の虫; **P≤0.01)。

以前の研究では、DBL-1 が細胞外マトリックス関連コラーゲンをコードする遺伝子を含むいくつかの遺伝子の発現を制御することが報告されていたため、次に、液体培養がコラーゲン変異体のダンピー表現型およびローラー表現型を抑制するかどうかを調査しました。 ダンピー dpy-5(e907) および rol-6(su1006) 変異体の体長は、液体培養と寒天培養で著しく増加しました (図 4a-d)。 さらに、rol-6(su1006)によって誘導される右手ローラー表現型の頻度は、液体培養によって減少しました(図4b)。 総合すると、図 1、2、および 3 に示した結果は、液体培養が筋ミオシン発現 (図 2) だけでなく、TGF-β/DBL-1 シグナル伝達の活性化 (図 3) を介して線虫の体格を変化させることを示唆しています。 ）だけでなく、細胞外マトリックス/コラーゲンの沈着に関しても同様です（図4）。

ダンピー表現型とローラー表現型は液体培養によって軽減されます。 dpy-5(e907) (a、b)、RW1596 rol-6 (su1006)、および Pmyo-3::GFP::myo-3 (c、d)、動物は湿った寒天上で増殖しました (a、c)、またはL1 幼虫期から液体培養 (b、d) で 4 日間培養します。 (e) 体長を測定した。 (f) RW1596 における右巻きローラー表現型の頻度を数えました。 バーとエラーバーは平均値と標準偏差を示します (条件あたり n=30 匹のワーム; *P≤0.05、**P≤0.01)。

C. elegans では、MEC-4 と MEC-10 で構成されるデジェネリン/上皮ナトリウム イオン チャネルが物理的刺激 (接触など) に対する機械センサーとして機能します。動的パラメーター、液体培養に応答した体長の変化を、デジェネリン チャネル変異体 (mec-4(e1611)、mec-10(e1515)、および unc-8(e15)) で評価しました。 mec-4(e1611) と mec-10(e1515) はどちらも液体培養に応答して体長の増加を示しましたが、unc-8(e15) は体長の有意な増加を示さなかった (図 5)。

UNC-8 デジェネリンは C. elegans の体長変化に必要です。 mec-4(e1611)、mec-10(e1515)、およびunc-8(e15)を、L1幼虫段階から開始して液体または寒天培養で4日間増殖させた。 体長を測定した。 バーとエラーバーは平均値と標準偏差を示します (条件あたり n=30 匹の虫; **P≤0.01)。

C. elegans の特徴的な這い歩きと泳ぎ歩きの間の移行は、生体アミン、ドーパミン、およびセロトニンによって制御されています 21。 したがって、我々は、セロトニン生合成酵素 tph-1(mg280) をコードする遺伝子に変異がある動物の体長の変化を測定しました。セロトニン/オクトパミン受容体ファミリーのメンバーであるser-5(ok3087)、およびD1様ドーパミン受容体であるdop-1(vs101)およびdop-4(tm1329)。 dop-4(tm1329) は体長の培養依存的な変化を示さなかった(図 6)。このことは、DOP-4 が体格の変化にも必要であることを示唆している。 対照的に、tph-1(mg280)、ser-5(ok3087)、および dop-1(vs101) では、液体培養と寒天培養では体長が有意に増加しました (図 6)。 次に、酸素と栄養素の感知から始めて、液体培養システムの体長に対する他の要因の影響を調査しました。 これを行うために、低酸素応答因子、hif-1(ia4)、インスリン/IGF-1様ペプチド、ins-7(ok1573)、およびインスリンの下流で作用する重要な転写調節因子をコードする遺伝子に変異を持つ動物を使用しました。 /IGF-1媒介シグナル伝達、daf-16(mu86)。 すべての場合において、これらの変異体では液体培養に応答して体長が増加した（図６）。 反応が遅く弛緩しているリアノジン受容体 unc-68(r1161)32 変異体も、液体培養では体長の増加を示しました (図 6)。 これらの結果は、液体培養に応じた C. elegans の体格の変化には、ある程度の神経筋シグナル伝達が必要であるが、酸素や栄養素の感知とは大きく異なることを示唆しています。

いくつかの C. elegans 変異体は、液体培養と寒天培養で野生型の体長の増加を示します。 試験したすべての変異体のうち、dop-4(tm1329) だけが液体培養で 4 日間後でも体長を増加させることができませんでした (条件あたり n=30 匹の虫; **P≤0.01)。

最後に、遊泳する虫で観察された収縮率の増加が体長の増加に関与しているかどうかを評価しました。 背側および腹側（DV）の頭部屈曲サイクルをさまざまな変異体でカウントしました（表 1）。 デジェネリンチャネル (unc-8); D1 様ドーパミン受容体 (dop-4)。 およびリアノジン受容体 (unc-68)。 unc-8(e15) はしばしば異常にカールし、液体でも寒天プレートでも DV サイクルを変化させませんでした。これは、水泳時にサイクルの正常な増加を示さない変異体と一致しました (表 1)。 対照的に、他のデジェネリン変異体である mec-4 および mec-10 は、水泳の動きに応じた動きや周期の増加において野生型と有意な差はありませんでした (mec-4 (e1611): 寒天上で 0.53±0.15 Hz、および 1.56±0.19液体中の Hz; mec-10 (e1515): 0.53±0.19 および 1.53±0.13 Hz、P>0.1)。 これらの観察は、体長の増加を示さない変異体（例えば、unc-8）は、水泳時にDVサイクルの増加も示さないことを示唆しています。 しかし、TGF-β シグナル伝達 (dbl-1 および sma-4) および D1 様ドーパミン受容体 (dop-4) 変異体は、同様に体長の増加を示さなかったが、実際には DV を示し、増加した。泳ぐときは自転車に乗る。 したがって、水泳が体長の増加に十分でない場合（例、dbl-1、dop-4、および sma-4）、DV サイクルの増加は必要ですが（例、unc-8）、必要な場合があります。

TGF-β シグナル伝達の要件をさらに評価するために、TGF-β、dbl-1 およびその下流シグナル、wrt-4.33 の遺伝子発現を定量的に測定しました。表 1 に示すように、unc-8(e15) および dop-4( tm1392)は、その体長が液体培養に応答して増加しなかった(図5および6)が、dbl-1またはwrt-4の誘導を示さなかった。 これらの結果は、unc-8 と dop-4 が dbl-1 の上流で作用して液体培養に対する反応を制御していることを示唆しています。 これと一致して、dbl-1 および sma-4 は、おそらくこれらの変異体では上流センサーが無傷であるため、dbl-1 の誘導を示しましたが、wrt-4 の誘導は示さなかったため、wrt-4 には TGF-β シグナル伝達が必要であることが確認されました。 4 液体培養に応じた誘導。 対照的に、unc-68(r1161) は体長と遺伝子発現を増加させました (表 1、図 5 および 6)。 これらの結果は、液体培養で体長を伸ばすには、(1) TGF-β/DBL-1 シグナル伝達が必須であるが、(2) 遊泳行動による DV サイクルの増加は必要かもしれないが、十分ではないことを示唆しています。

C. elegans は、土壌や朽ち果てた植物の中に見られる自由生活性の線虫で、表面が湿った粒子上や水生条件に生息します。 C. エレガンスは、少なくとも 2 つの異なる運動歩行を示します。液体の中では泳ぎ、表面では這います。17-21 C. エレガンスを湿った表面に保持するには表面張力が必要で、その値は 10,000 × G 程度であると予測されています。28 ,34,35 したがって、表面上での這い歩きは、表面張力と液体の流れの力学によって引き起こされる大きな力の結果であると考えられます。20 這い歩きは大きな外部負荷によって引き起こされ、外部負荷に対抗するためにかなりの筋力が使用されます。そして身体を動かします。 この推測を裏付けるように、液体の粘度が増加すると、泳ぐか這うかのような起伏の間の連続的な歩行の移行が以前に観察されています。20

しかし、これらの観察は、C. elegans の体格が液体と寒天上で大きく変化する理由を十分に説明するものではありません。 必然的に、歩行の変化は短期的な適応反応でなければなりませんが、体格の変化は通常、長期的な適応反応です。

クロールと水泳は全く異なる行動です。 湿った寒天上を這う C. エレガンスは、0.5 ～ 0.8 Hz の周波数で平均振幅 135°の S 字型姿勢の背腹屈曲を示します。18,21 対照的に、遊泳する C. エレガンスは C 字型の背腹屈曲を示します。 1.7 ～ 2.1 Hz の周波数で平均振幅 45 度の姿勢を示します。18,21 さらに、C. エレガンスは 45 分間以上、長時間連続して泳ぎます 21。これらの背腹屈曲の周波数、振幅、伝播における定量的に異なる行動は、環境に最も適した体格を形成するために遺伝子発現を変化させる、明確な長期適応反応を誘発する可能性があります。

液体中で培養した場合、ミオシン重鎖遺伝子 myo-3 およびその転写活性化因子である hlh-1 (MyoD) の体長および発現レベルは、寒天上で培養した場合と比較して増加しました。 これらは、液体環境での成長に対する長期的な適応反応であると考えられます。 C. エレガンスの体長を調節することがすでに知られている重要なシグナル伝達経路である TGF-β/DBL-1 シグナル伝達経路 11-16 は、液体培養に応じた体格変化に必要であり、液体培養に応じて転写誘導されるものでした。 dbl-1 発現は液体培養物の粘度と深さの増加の両方によって誘導されるため、液体培養に応答した dbl-1 発現の誘導は流体力学によるものと考えられます (図 1)。 興味深いことに、dbl-1 発現は、宇宙微小重力下ではなく、国際宇宙ステーションに搭載された 1G 遠心分離機での液体培養によって誘導されました (図 1)。 宇宙で 1G 加速して培養された線虫にかかる静水圧の増加が dbl-1 発現に影響を与えた可能性があります。 我々は静水圧を測定していないため、静水圧に応じたdbl-1発現の変化を調べる今後の実験が必要である。

C. elegans では、デジェネリン/上皮 Na+ チャネルファミリーメンバーがさまざまな物理的刺激に対する機械センサーとして機能します。 したがって、我々は、それらが流体力学を感知し、dbl-1 発現に影響を与えているのではないかということに興味を持ちました。 MEC-4 と MEC-10 は、接触感受性ニューロンにおいてイオン細孔形成サブユニットのヘテロ複合体を形成しており 22-24、この複合体は超重力への応答に不可欠です 25。 しかし、液体培養では体サイズが、 MEC-4/10 ヘテロ複合体は、この複合体が流体力学に応答して体格を変化させるのに必要ではないことを示唆しています。 代わりに、他のデジェネリン/上皮 Na+ チャネルファミリーメンバー、特に UNC-8 が流体力学に応答した体格の変化に必要であることを発見しました (図 1)。 これは、それらが流体応答性の機械受容体として機能している可能性があることを示唆しています。 UNC-8 は腹髄運動ニューロンで発現します。36-38 さらに、C. エレガンスの体の大きさを用量依存的に調節する TGF-β/DBL-1 は、主に運動ニューロンと神経環で発現します。12、その部位は既知です。 dbl-1 の発現は、既知の UNC-8 作用部位と密接に一致します。 したがって、UNC-8 デジェネリン複合体は、培養条件からの物理的刺激、および/または体の姿勢の変化、および/または歩行の変化によって生じる緊張を感知し、DBL-1 の上方制御につながる可能性があります。 その後、上方制御された DBL-1 リガンドは、既知の機構を介して筋肉および皮下細胞に作用し、筋ミオシンおよびキューティクルコラーゲンの発現を促進することによって体格を制御します。

別の可能性として、unc-8(e15)変異体は液体中と寒天表面の両方で通常の運動行動を完全に失うため、体格を変えるために水泳行動が必要である可能性があります(表1)。 最後に、流体力学、特に液体の粘性に伴う静水力と抗力が、活動性の低い人々の骨と骨格筋の形成を促進するため、これが活動性の低い線虫にも当てはまるかどうかに興味がありました。 実際、動きが鈍く弛緩した変異体であるunc-68は、液体培養に反応して体長の増加を示した(図6)。 これは、活動に依存しない流体力学効果、おそらく浮力によって移動が容易になることが、C. elegans と人間の間で進化的に保存されているようであることを示唆するだけでなく、C. elegans が不活動の影響を研究し、それに対抗するのに適したモデルである可能性があることも示唆しています。人間の筋肉について。

最近の研究により、C. elegans は生体アミン (ドーパミンとセロトニン) を利用して、這い歩きと水泳の間の歩行移行を制御しており、これは短期的な適応であることが明らかになりました 21。 ドーパミンは、水中で泳いだ後、陸上で這いを開始して維持するために必要であり、セロトニンは、這いから水泳行動に移行するために必要です。 私たちは、この短期的な適応が体格の長期的な適応にも役割を果たしているかどうかに興味がありました。 dop-1、ser-5、および tph-1 の変異は液体培養に応答して野生型の体長の増加を示しましたが、dop-4 変異体は長さの増加を示しませんでした。 これは、DOP-4が短期的な歩行適応だけでなく、液体培養への長期的な体格適応にも必要であることを示唆しています。 DOP-4 は D1 様ドーパミン受容体であり、水中での採餌や這う姿勢などの特定の行動のアルコール誘発性脱抑制に関与することが知られています 39。したがって、DOP-4 は C. エレガンスの適応における重要な要素として機能する可能性があります。短期および長期の両方の適応反応に関与する水生環境への影響。

野生と同様、液体中で生育する C. エレガンスは低酸素状態になり、栄養が制限される可能性があります。 したがって、これらの要因が液体培養における体長の増加に寄与する可能性があるかどうかを調査しました。 しかし、hif-1、ins-7、daf-16 の変異はすべて野生型と同様に反応し、酸素感知も栄養感知も体長の増加に寄与していないことが示唆されました。 UNC-8 および/または DOP-4 が流体力学を感知しているようであり、試験した野生型および他のすべての変異体が液体培養または寒天培養のいずれでも同じ速度で発生したことを考慮すると、これは驚くべきことではないかもしれません。

結論として、我々の結果は、UNC-8および/またはDOP-4が、粘度/抗力およびおそらく静水圧を含む流体力学特性の神経センサー/伝達物質として機能する可能性があることを示唆しています。 流体力学特性によるこれらの神経センサー/伝達物質の活性化により、dbl-1 の発現が増加し、DBL-1 シグナル伝達が増加し、体のサイズと筋タンパク質の発現が増加すると考えられます。

C.エレガンスN2ブリストル株を野生型として使用した。 変異株は次のとおりです。BC15777 誘導体: dpy-5(e907)。 RW1596: myo-3(st386)、stEx30 [myo-3p::GFP+rol-6(su1006)]; LT121: dbl-1(週70); NU3: dbl-1(nk3); DR1369: sma-4(e729); CB1611: mec-4(e1611); CB1515: mec-10(e1515); CB15: unc-8(e15); ZG31: hif-1(ia4); CF1038: daf-16(mu86); RB1388: ins-7(ok1573); GR1321: tph-1(mg280); RB2277: ser-5(ok3087); LX636: dop-1(vs101); FG58: dop-4(tm1392); TR2170: unc-68(r1161)。 これらの株は、Caenorhabditis Genetics Center (ミネソタ大学、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) から入手しました。

30 ～ 50 匹の野生型または変異体成体雌雄同体を、食物源として大腸菌 OP50 株を表面に広げた、新しく調製した線虫増殖培地 (NGM) 寒天プレート (Φ6 cm プラスチック培養皿) に移しました。 成虫は 20 °C で 4 時間産卵させました。 これにより、各皿に少なくとも 500 個の卵ができました。 成体および細菌の食物源を、2mlのM9緩衝液で3回穏やかにピペッティングすることによってプレートから洗い流した。 残りの卵を20℃でさらに12時間放置し、その時点で孵化したL1幼虫を500μlのM9緩衝液中に収集した。 条件ごとに 60 匹の L1 幼虫を、OP50 NGM 寒天プレート上、または Φ6 cm プラスチック内の大腸菌 OP50 (OD600 = 1.0; 液深 = 0.8 mm) を含む 2 ml 液体 NGM 培養システムのいずれかで 20 °C で同時に培養しました。文化的な皿。 栽培の3日後、産卵の開始によって証明されたように、この研究で試験された野生型および他のすべての変異体は若年成人まで成長した。 これは両方の培養条件下で観察されました。 飢餓を防ぐために、成体動物をΦ0.2 mmの白金ワイヤーを使用して摘出し、毎日新しい培地に移しました。 両方の培養条件で転移が発生しました。

遺伝子発現に対する液体粘度の影響を研究するため（以下を参照）、大腸菌 OP50（OD600=1.0）を含む 2.0 ml の NGM 液体培地中の最終濃度 1.0 および 1.5% メチルセルロースを使用しました。 粘度計 Visoboy2 (LAUDA、ドイツ) で測定した動粘度は、対照 OP50 NGM 液体では 1.0 cSt (mm2/s)、1.0% メチルセルロースでは 36.1 cSt、1.5% メチルセルロースでは 123.3 cSt でした。

液体培養の深さの影響を研究するために、Φ6 cm プレートの OP50 NGM 寒天をさらに 1.5 ml (深さ約 0.6 mm)、3.0 ml (深さ約 1.2 mm)、または 4.5 ml (深さ約 1.8 mm) で覆いました。大腸菌ＯＰ５０（ＯＤ６００＝１．０）を含むＮＧＭ液体培地の深さ）。 L1 から成体になるまで、すべての動物は完全に覆われており、最も浅い状況でも遊泳行動を示しました。

C.エレガンスの体長は、若年期（L1幼虫として開始してから3日後）とその後の3日間で評価されました。 毎日、培養動物のサブセットを 1% パラホルムアルデヒドで室温で 30 分間固定し、BX51 顕微鏡と DP71 カメラ (Olympus Optical、東京、日本) を使用して画像化しました。 体長は、CellSens画像解析ソフトウェア(Olympus)を使用して測定した。 各実験は、3 つの独立したサンプルを使用して 3 回実行されました (時点ごとに合計 n=60 匹の虫)。 統計分析は MS Excel (Microsoft Co.、米国ワシントン州レドモンド) で実行されました。 スチューデントの両側 t 検定を使用して、統計的有意性を P<0.05 に設定しました。

各アッセイは、液体または水分寒天プレート上で培養した L1 幼虫から採取した 4 日後の 10 匹の、決して飢えていない成虫に対して行われました。 DV 頭部屈曲サイクルは、各培養プレートを軽く叩いた直後に、実体顕微鏡下で水泳または匍匐の収縮率として 30 秒間計測されました。

指定された培養日に、TRIzol (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) を使用して、約 300 匹の成人雌雄同体から全 RNA を単離しました。 定量的リアルタイム PCR 分析は、CFX96 Touch Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA) および SYBER ExScript RT-PCR Kit (TaKaRa Bio、滋賀県、日本) を使用して実行されました。 伸長因子 eef-2 の発現レベルを内部標準として使用し、各遺伝子の遺伝子発現の相対比を前述のように計算しました 40。 以下のプライマー セットを使用して eef-2、hlh-1、myo-2 を増幅しました。 3、dbl-1、および wrt-4: eef-2 (順方向) 5'-GAC GCT ATC CAC AGA GGA GG-3' および (逆方向) 5'-TTC CTG TGA CCT GAG ACT CC-3'。 hlh-1 (順方向) 5'-GCT CGG GAA CGC GGT CGA-3' および (逆方向) 5'-GGA ATG CTC GCA ACG ATC CGC GA-3'。 myo-3 (順方向) 5'-ACT CTC GAA GCC GAA ACC AAG-3' および (逆方向) 5'-TGG CAT GGT CCA AAG CAA TC-3'。 dbl-1 (順方向) 5'-CAG TTT GGC TTC GAT TGC TC-3' および (逆方向) 5'-TGA AGC TGG TCC TCT GTC TG-3'。 wrt-4 (順方向) 5'-TGG ATG AGC TCG CAG TGG-3' および (逆方向) 5'-CTC CGT TGT CAA GTG TGA ATT CTA C-3'。 リアルタイム PCR 実験は、各生体サンプルに対して 3 回実行されました。

また、CERISE から宇宙飛行した生後 4 日の野生型成体におけるいくつかの遺伝子の発現レベルも測定しました。30,31

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私たちは、STS-129、STS-130、および国際宇宙ステーションに関するCERISEの乗組員全員に感謝します。 CERISEはJAXAの支援を受けて開催されました。 また、突然変異株をご提供いただきました Caenorhabditis elegans Genetic Center にも感謝いたします。 この研究は、JSPS KAKENHI 助成金番号 26506029、15H05937、省庁横断的な戦略的イノベーション推進プログラム (J150000592)、英国医学研究評議会 (G0801271)、および国立衛生研究所 (NIH NIAMS ARO5434​​2) によっても支援されました。 本研究は、文部科学省、日本学術振興会（15H05937、26506029）、府省横断的戦略的イノベーション創造プログラム（J150000592）、JAXA宇宙科学研究所細胞生物学実験事業の助成を受けて行われました。 TE は英国医学研究評議会 (G0801271) の支援を受けました。 NJS は国立衛生研究所 (NIH NIAMS ARO5434​​2) によって支援されました。

Shunsuke Harada

現住所：9現住所：神戸市立大学医学部

原田俊介と橋爪塔子：これらの著者はこの作品に等しく貢献しました。

東北大学大学院生命科学研究科環境生命科学専攻

Shunsuke Harada, Kanako Nemoto, Zhenhua Shao, Nahoko Higashitani & Atsushi Higashitani

アドバンスト・エンジニアリング・サービス、つくば市、日本

Toko Hashizume

協力 鹿児島大学大学院医歯学総合研究科宇宙環境医学分野

Toko Hashizume & Akira Higashibata

エクセター大学、生命環境科学部スポーツ健康科学部、エクセター、英国

ティモシー・エサリッジ

MRC/ARUK 筋骨格老化研究センターおよび国立スポーツ運動医学センター、ロイヤル ダービー病院、ノッティンガム大学、英国ダービー

ナサニエル・J・シェブチック

日本宇宙フォーラム、千代田区

Keiji Fukui

宇宙航空研究開発機構有人宇宙飛行技術部門（つくば市）

Akira Higashibata

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AtsH が研究を設計しました。 SH、TH、KN、ZS、NH、AkH は遺伝子発現解析と顕微鏡観察を行いました。 KF と AkH は CERISE 飛行実験を調整しました。 SH、AkH、TH、KN、TE、NJS、AtsH がデータを分析し、論文を執筆しました。

Correspondence to Atsushi Higashitani.

著者は利益相反がないことを宣言します。

この作品は、クリエイティブ コモンズ 表示 - 非営利 - 改変禁止 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材がクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

原田 晋、橋爪 達也、根本 和也 他流体力学は、TGF-β/DBL-1 神経筋シグナル伝達を介して線虫の体長を変化させます。 npj 微小重力 2、16006 (2016)。 https://doi.org/10.1038/npjmgrav.2016.6

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受信日: 2015 年 4 月 30 日

改訂日: 2015 年 12 月 14 日

受理日: 2016 年 1 月 10 日

公開日: 2016 年 4 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/npjmgrav.2016.6

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